海爾生物醫療(liáo)新(xīn)guan肺炎檢測PCR實(shí)驗(yàn)室(shì)建設場景(jǐng)方案一(yī) 成(chéng)都(dū)壹科醫(yī)療(liáo)器械有限公司(sī)
自(zì)新型guan狀病毒(dú)發現(xiàn)以來(lái)，特別(bié)是(shì)PCR實(shí)驗室新型guan狀病(bìng)毒核酸檢測(cè)工(gōng)作任(rèn)務(wù)艱巨。先介紹一下(xià)PCR檢(jiǎn)測(cè)的流程：
1 試(shì)劑製備區(qū)
功能(néng)：主(zhǔ)要(yào)是作為(wéi)貯(zhù)存試(shì)劑的製備，試劑(jì)的(dí)分(fēn)裝和主反(fǎn)應(yīng)混合液的製備(bèi)，試劑(jì)和用(yòng)於標本製(zhì)作(zuò)的材(cái)料應(yīng)直接運(yùn)送至該區，不得(dé)經過其它(tā)區(qū)域。試劑(jì)原材(cái)料(liào)需(xū)貯存在本區(qū)內，並在本(běn)區內(nèi)製備(bèi)成所需的貯存(cún)試劑。所(suǒ)需要(yào)的儀(yí)器(qì)設備(bèi)：
天(tiān)平（用於(yú)精(jīng)確稱(chēng)量(liáng)各(gè)類試劑）→超(chāo)淨(jìng)工(gōng)作台(tái)（涉及(jí)對細(xì)菌(jūn)的操作均需(xū)在超(chāo)淨工(gōng)作台(tái)下完成）→移(yí)液器(qì)（準確(què)量取(qǔ)特(tè)定體積溶液20-100ul）→純水（超純(chún)水18.2ΩM.CM）→藥品冷藏箱（短(duǎn)期(qī)保存 ）→試(shì)劑低(dī)溫冰(bīng)箱(xiāng)（可(kě)選2-8°，-20℃）→混(hùn)匀儀（移(yí)取(qǔ)樣本前需要混匀(yún)）（推(tuī)薦艾(ài)本森品牌(pái)：MixMax漩(xuán)渦混匀(yún)儀）→消(xiāo)毒(dú)車（空間環境(jìng)消毒(dú)）→滅菌(jūn)鍋（實驗室(shì)物(wù)品(pǐn)，試劑，培(péi)養基消毒滅菌(jūn)）→PH計（配(pèi)置試劑是精(jīng)確測(cè)量PH值）
2 樣(yàng)本(běn)製(zhì)備區(qū)
功能(néng)：臨(lín)床標本(běn)的保(bǎo)存(cún)，核酸(suān)(RNA，DNA)提(tí)取(qǔ)，貯存(cún)及(jí)其加(jiā)入(rù)至擴增反(fǎn)應(yīng)管和測(cè)定RNA時DNA的合(hé)成(chéng)。所(suǒ)需要(yào)的(dí)儀器設備
生(shēng)物(wù)安全櫃(guì)（為(wéi)了防止有(yǒu)害懸浮(fú)微(wēi)粒，氣溶膠的(dí)擴散）→樣本(běn)低溫冰(bīng)箱(xiāng)（-20℃，-80℃保存樣(yàng)本(běn)及DNA）→高速台式冷凍(dòng)離心(xīn)機(jī)（用於收集微(wēi)生物(wù)菌(jūn)體，細(xì)胞(bāo)碎(suì)片以及其他沉澱物(wù)，有(yǒu)些(xiē)樣(yàng)品由(yóu)於(yú)在(zài)常(cháng)溫(wēn)下不(bù)太穩(wěn)定，需(xū)要(yào)低溫環境）→恒溫金屬浴（用(yòng)於DNA雜交過(guò)程中水浴控溫）（HtPot40恒(héng)溫(wēn)金(jīn)屬浴）→移液(yè)器（準(zhǔn)確量(liáng)取(qǔ)特(tè)定體(tǐ)積溶液(yè)）→紫(zǐ)外燈或者消毒車（空間(jiān)環境消毒(dú)）→混(hùn)匀儀(yí)（移(yí)取樣(yàng)本前需(xū)要混匀(yún)）（推薦(jiàn)艾本森(sēn)品(pǐn)牌：MixMax漩(xuán)渦混(hùn)匀儀）→超淨工(gōng)作台(tái)（涉及對細菌的(dí)操作(zuò)均(jūn)需(xū)在(zài)超淨(jìng)工作(zuò)台下(xià)完成）→低溫搖床(chuáng)（用(yòng)於大腸杆菌(jūn)和酵母(mǔ)菌的振(zhèn)蕩培養）→磁力攪拌器(qì)(加速溶解(jiě)固(gù)體(tǐ)內容物 )
3 核酸擴增區
功能(néng)：主要是(shì)DNA擴增(zēng)，已(yǐ)製備(bèi)的DNA模(mó)板(bǎn)和合(hé)成的DNA和(hé)主(zhǔ)反應混(hùn)合液，製(zhì)備成反應混合液等，也可以(yǐ)在(zài)本區(qū)域內(nèi)進(jìn)行(háng)。在PCR測(cè)定中(zhōng)，通(tōng)常在擴(kuò)增後(hòu)須打開反應(yīng)管。
基因(yīn)擴增儀 （基因檢(jiǎn)測(cè)DNA/RNA擴(kuò)增(zēng)）→熒(yíng)光(guāng)定量PCR儀（核酸(suān)定量分(fēn)析）→核(hé)酸提取儀（樣(yàng)品(pǐn)DNA/RNA提取(qǔ)）→移液器（準確量取(qǔ)特定體積(jī)溶液(yè)）→紫外燈或(huò)者消(xiāo)毒車 （空間環境(jìng)消毒）→超淨工(gōng)作台（涉及(jí)對細菌(jūn)的操作(zuò)均需在超淨工作台(tái)下完成 ）→純(chún)水(shuǐ)裝(zhuāng)置（用(yòng)於PCR，DNA測(cè)序需(xū)要超純水(shuǐ)）
4 產物分析區
功能：主要進行(háng)的操作為擴(kuò)增片(piàn)段的(dí)測定，如(rú)使(shǐ)用全自(zì)動(dòng)封(fēng)閉分析(xī)儀器檢(jiǎn)測，需(xū)要(yào)儀器(qì)設(shè)備(bèi)：
基因擴增儀(yí) （基(jī)因檢(jiǎn)測DNA/RNA擴增(zēng)）→熒(yíng)光定(dìng)量(liáng)PCR儀（核(hé)酸(suān)定(dìng)量分析）→核酸(suān)提取儀（樣品DNA/RNA提(tí)取(qǔ)）→移液器(qì)（準確量取(qǔ)特定體(tǐ)積(jī)溶(róng)液(yè)）→紫外(wài)燈或(huò)者(zhě)消毒車(chē) （空(kōng)間環(huán)境消(xiāo)毒）→超(chāo)淨工作台（涉及(jí)對細(xì)菌(jūn)的操作(zuò)均(jūn)需在超淨(jìng)工作(zuò)台下完成(chéng) ）→純水(shuǐ)裝置（用於PCR，DNA測序(xù)需(xū)要超純水 電泳(yǒng)儀（水平電泳(yǒng)用於核酸(suān)DNA/RNA檢(jiǎn)測(cè)，垂(chuí)直(zhí)電(diàn)泳用(yòng)於(yú)蛋(dàn)白檢測，轉(zhuǎn)印(yìn)電(diàn)泳用(yòng)於(yú)將(jiāng)蛋(dàn)白(bái)轉(zhuǎn)印(yìn)到(dào)膜(mó)上(shàng)做western檢測）→凝(níng)膠(jiāo)成像係統/紫外檢測(cè)儀(yí)（用於(yú)核酸瓊脂(zhī)電泳和蛋白聚(jù)丙(bǐng)酰胺的觀(guān)察和(hé)拍(pāi)照，紫(zǐ)外(wài)分析儀用於(yú)染色(sè)後核酸(suān)瓊脂(zhī)電泳膠觀察，不能連(lián)接電腦）→電爐（電泳瓊(qióng)脂(zhī)凝(níng)膠(jiāo)加熱(rè)融化(huà)）
新(xīn)型guan狀病毒（2019-nCov）核酸(suān)檢測(cè)流(liú)程(chéng)
北京協和(hé)醫(yī)院(yuàn)近期發布了(liǎo)《新(xīn)型guan狀(zhuàng)病毒(dú)核(hé)酸(suān)檢測》標準操作(zuò)流程。這(zhè)為(wéi)我(wǒ)們建(jiàn)設(shè)2019-nCov新(xīn)型guan狀(zhuàng)病毒P3實驗室建設(shè)提供(gōng)了科學指導。
（PCR核酸檢(jiǎn)測(cè)實驗室(shì)布局(jú)建(jiàn)設(shè) SICOLAB）
具體(tǐ)檢測(cè)流程如下(xià)
一，核(hé)酸(suān)檢(jiǎn)測(cè)前(qián)的生物(wù)安全防護(hù)（工(gōng)作人員個(gè)人(rén)三級(jí)防護的穿(chuān)戴）
1，穿戴(dài)流程(chéng)：
在基因擴增實驗室的(dí)清(qīng)潔(jié)區（更衣區）或(huò)者(zhě)普(pǔ)通(tōng)實驗室(shì)的潔(jié)淨區(qū)，工(gōng)作人(rén)員按順(shùn)序(xù)依次(cì)穿戴好(hǎo)一次性(xìng)帽(mào)子(zǐ)，醫用N95，一次性(xìng)防hu服(fú)，一次(cì)性(xìng)鞋(xié)套，一次性防水靴套，防護目(mù)鏡和雙層乳(rǔ)膠手(shǒu)套，進入樣本(běn)處理工作(zuò)區(qū)域或實驗室(shì)。
2，要點(diǎn)提(tí)示：
2.1，具備(bèi)標準基因擴(kuò)增布(bù)局條(tiáo)件的(dí)實驗室(shì)，應(yīng)在清(qīng)潔更(gēng)衣區(qū)做好個(gè)人(rén)三級防護，條件有限(xiàn)的(dí)實驗室亦可選擇(zé)在(zài)一潔淨的(dí)實驗室(shì)中按流(liú)程穿戴好(hǎo)個人三級防(fáng)護(hù)。
2.2，需(xū)佩戴(dài)醫用(yòng)N95，若無醫(yī)用N95，可以考慮用普(pǔ)通N95/KN95外加一次(cì)性(xìng)外科(kē)的組(zǔ)合方式(shì)，但(dàn)不要佩戴有呼吸(xī)閥(fá)的N95。
2.3，佩(pèi)戴(dài)N95時需(xū)檢查(chá)密(mì)閉性，通過雙(shuāng)手按(àn)壓，深(shēn)呼(hū)吸，左(zuǒ)右轉頭等動(dòng)作(zuò)嚴格(gé)檢查(chá)是否佩(pèi)戴(dài)正(zhèng)確(què)。
2.4，一次(cì)性防hu服已(yǐ)具(jù)備(bèi)新型(xíng)guan狀(zhuàng)病(bìng)毒核酸(suān)檢(jiǎn)測(cè)的防護(hù)需(xū)求，有條件時(shí)可以考(kǎo)慮(lǜ)加(jiā)穿一(yī)次(cì)性(xìng)反穿隔離(lí)衣，穿(chuān)衣時(shí)需(xū)由(yóu)他(tā)人(rén)協(xié)助(zhù)。
2.5，穿戴(dài)整(zhěng)齊的工作(zuò)人(rén)員(yuán)，應按(àn)要求(qiú)盡快(kuài)進(jìn)入(rù)樣本(běn)處理(lǐ)的實(shí)驗區域(yù)開展(zhǎn)工作，嚴禁(jīn)穿戴(dài)三(sān)級防(fáng)護後再進入普(pǔ)通(tōng)實(shí)驗區(qū)域(yù)或辦公區域。
二，樣(yàng)本的滅(miè)活處(chǔ)理(lǐ)
1，操作流程(chéng)：
兩(liǎng)名完成(chéng)三級防(fáng)護(hù)的(dí)工(gōng)作人員，進入(rù)樣本(běn)處(chǔ)理區或(huò)樣本處(chǔ)理(lǐ)實(shí)驗室(shì)，將(jiāng)接(jiē)收到(dào)的(dí)樣本二級(jí)包(bāo)裝(zhuāng)在(zài)安(ān)全櫃內打(dǎ)開，檢查樣本主(zhǔ)容(róng)器是否(fǒu)為嚴格(gé)密閉；對密封(fēng)袋表(biǎo)麵(miàn)進行(háng)消(xiāo)毒(dú)後(hòu)，對(duì)送(sòng)檢(jiǎn)樣(yàng)本進行56℃下30分鐘(zhōng)的滅(miè)活(huó)，滅活後的(dí)樣(yàng)本管需在(zài)生(shēng)物(wù)安(ān)全櫃內(nèi)打(dǎ)開(kāi)內層的容器，將拭(shì)子保(bǎo)存(cún)液(yè)混(hùn)匀(yún)後(hòu)進行分裝和用(yòng)於核酸(suān)提取。
2，要點(diǎn)提(tí)示：
2.1，涉及高致(zhì)病性病原微生(shēng)物的實驗(yàn)室活動(dòng)，需由兩(liǎng)名工(gōng)作人(rén)員完成，其(qí)中一(yī)人(rén)負責主(zhǔ)要(yào)實驗操作，一(yī)人提(tí)供(gōng)必(bì)要的協助。主操作者應避免反(fǎn)復(fù)多(duō)次進(jìn)出(chū)安全(quán)櫃。
2.2，滅活形式：可以采用水浴(yù)或空氣加熱(rè)形式完成滅(miè)活，采用空氣(qì)加熱時可適(shì)當延長(cháng)滅(miè)活時(shí)間(jiān)。有條(tiáo)件時可(kě)以(yǐ)采用(yòng)小型化(huà)設備(bèi)在(zài)安全櫃(guì)內(nèi)操作，減(jiǎn)少樣本進(jìn)出(chū)安全櫃(guì)的(dí)次數。滅(miè)活前的樣本(běn)嚴禁(jīn)在生(shēng)物(wù)安全櫃外打開(kāi)和(hé)操作。
2.3，應(yīng)特(tè)別檢(jiǎn)查采(cǎi)樣管是否(fǒu)擰(níng)緊(jǐn)，有無樣本溢漏等情(qíng)況(kuàng)。
2.4，樣(yàng)本管每次進出安全櫃均需對外(wài)表麵(miàn)進(jìn)行消毒。
2.5，應(yīng)就近(jìn)配備(bèi)適(shì)量(liáng)的(dí)消(xiāo)毒(dú)處理物品，以防止(zhǐ)實(shí)驗操作(zuò)過程(chéng)中(zhōng)可(kě)能(néng)發生的(dí)意外(wài)溢(yì)灑事(shì)故，有條(tiáo)件時(shí)建議(yì)在安(ān)全櫃(guì)內配備一次(cì)性吸(xī)水(shuǐ)台布(bù)。
三(sān)，樣本(běn)的(dí)核酸提取
1，手工(gōng)核(hé)酸提取操作(zuò)流(liú)程（以凱傑的52906柱提法核酸提取試(shì)劑(jì)盒為例(lì)）
1.1，裂(liè)解液配製(zhì)：在基因(yīn)擴增實驗室(shì)的(dí)試劑配(pèi)製(zhì)區或單(dān)獨的(dí)普(pǔ)通試劑配(pèi)製實驗(yàn)室中，準備核(hé)酸(suān)提取所需(xū)的(dí)洗液1（AW1），洗(xǐ)液2（AW2）和carrier RNA。按照(zhào)要求，分別(bié)向洗(xǐ)液(yè)1和洗液2中加入(rù)分子生物學(xué)級(jí)別的(dí)130ml和160ml的無(wú)水乙醇並及時(shí)做(zuò)好(hǎo)標記；取(qǔ)310μl洗(xǐ)脫液（AVE）溶(róng)解(jiě)310μg/支的Carrier RNA。配置(zhì)好後，通(tōng)過傳遞(dì)窗(chuāng)進(jìn)入核酸(suān)提取區或由工(gōng)作人員(yuán)送入(rù)核酸(suān)提(tí)取(qǔ)實驗(yàn)室。
1.2，樣本裂解：取560μl AVL裂(liè)解(jiě)液到1，5ml無菌EP管(guǎn)中，加入5，6μl配製好(hǎo)的Carrier RNA，再(zài)加入已經(jīng)滅(miè)活(huó)的(dí)140μl樣本（例如咽拭子，血漿(jiāng)等(děng)），混(hùn)匀振蕩15秒，室溫靜置(zhì)10分鐘(zhōng)，充(chōng)分(fēn)裂解樣本(běn)中(zhōng)的核(hé)酸。將EP管(guǎn)瞬(shùn)時(shí)離心後加(jiā)入(rù)560μl無水(shuǐ)乙(yǐ)醇，充分(fēn)混(hùn)匀(yún)15秒，再(zài)次(cì)瞬(shùn)時離心後(hòu)備用。吸(xī)取(qǔ)630μl裂解產物，小心加(jiā)入(rù)至(zhì)離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分(fēn)鐘，轉(zhuǎn)移(yí)離心(xīn)柱至新收(shōu)集管(guǎn)，將剩(shèng)餘630μl裂解(jiě)產(chǎn)物加到(dào)離(lí)心柱中，重(zhòng)復上一離(lí)心操(cāo)作(zuò)（若樣本體(tǐ)積大(dà)於(yú)140μl，則在此(cǐ)步(bù)驟重復將630μl裂解產(chǎn)物過(guò)濾收集在一(yī)個(gè)離心(xīn)柱上）。
1.3，核酸(suān)的洗滌：取500μl洗液(yè)1（AW1）至離心柱中(zhōng)，8000rpm（或(huò)6000g）離心1分鐘(zhōng)；換(huàn)新收集(jí)管後(hòu)，取(qǔ)500μl洗(xǐ)液2（AW2）至(zhì)離心柱中(zhōng)，8000rpm（或(huò)6000g）離(lí)心1分(fēn)鐘；換新收集管後，用(yòng)14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除(chú)洗液2（AW2）；換(huàn)新收(shōu)集(jí)管(guǎn)後(hòu)，繼續用(yòng)離(lí)心機大轉速(sù)（20000g）離心1分鐘(zhōng)，充(chōng)分甩(shuǎi)離(lí)殘(cán)留的(dí)洗(xǐ)液2（AW2）。
1.4，核(hé)酸的洗脫(tuō)和(hé)回收(shōu)：取(qǔ)一(yī)1，5ml無菌EP管(guǎn)，將(jiāng)離(lí)心(xīn)柱(zhù)放入其中，加(jiā)入(rù)洗脫(tuō)液（AVE）40~60μl，室溫(wēn)靜置1分(fēn)鐘(zhōng)後，用8000rpm離(lí)心1分(fēn)鐘回收核(hé)酸(suān)，以(yǐ)備PCR檢測(cè)使用(yòng)。
1.5，要(yào)點提示(shì)：
（1），新(xīn)鮮(xiān)裂解液的(dí)配(pèi)製(zhì)應(yīng)盡(jìn)可(kě)能在專(zhuān)門的潔(jié)淨區(qū)域或單獨(dú)的(dí)實(shí)驗室(shì)進(jìn)行。
（2），要用(yòng)分(fēn)子生(shēng)物(wù)學級別的(dí)無水(shuǐ)乙醇(chún)試(shì)劑(jì)進行配製(zhì)。
（3），向(xiàng)離心柱(zhù)中(zhōng)加入(rù)裂解(jiě)產(chǎn)物(wù)，洗(xǐ)液時操(cāo)作要非常(cháng)小(xiǎo)心，盡量將洗頭(tóu)下(xià)探到離(lí)心柱內部(bù)後靠管(guǎn)壁加樣(yàng)，切(qiē)忌出(chū)現(xiàn)溢灑後(hòu)汙染到離心(xīn)柱的密封圈，這可(kě)能(néng)會導(dǎo)致乙(yǐ)醇(chún)殘留(liú)，抑(yì)製後續PCR反應(yīng)。
（4），從離心(xīn)機(jī)中取(qǔ)出(chū)離(lí)心柱時應小心操作(zuò)，避免(miǎn)離心柱(zhù)下(xià)緣被收集管中的濾(lǜ)過殘(cán)液汙染(rǎn)。
（5），加入(rù)洗液2（AW2）後的(dí)第二(èr)次(cì)空管全速離心(xīn)非(fēi)常關鍵，能(néng)幫(bāng)助(zhù)充分甩離離(lí)心柱濾膜(mó)中殘留的(dí)洗液2殘液，確(què)保洗(xǐ)脫核(hé)酸的純(chún)度。
（6），洗脫液加樣時需(xū)小心操(cāo)作(zuò)，確保(bǎo)洗(xǐ)脫液盡(jìn)可能(néng)覆(fù)蓋全部離心柱濾(lǜ)膜，充分洗脫核(hé)酸，提高核酸(suān)提(tí)取(qǔ)的(dí)產量。
（7），手工(gōng)核酸提(tí)取(qǔ)可(kě)優(yōu)選使(shǐ)用(yòng)檢測試(shì)劑盒說明(míng)書推薦(jiàn)的配(pèi)套手工提(tí)取(qǔ)試(shì)劑(jì)，也可選用通(tōng)用(yòng)手工提取(qǔ)試劑(jì)。
（8），樣本(běn)處(chǔ)理(lǐ)過程中，工作人員覺(jué)得有(yǒu)必要時，應(yīng)隨(suí)時(shí)更換新的(dí)外層乳膠(jiāo)手套。
2，采(cǎi)用核酸提取儀(yí)提取(qǔ)核(hé)酸的操(cāo)作(zuò)流程
根據核(hé)酸(suān)提取(qǔ)儀和(hé)試劑(jì)的(dí)說(shuō)明(míng)書準備(bèi)好(hǎo)提取(qǔ)試劑，取200μl樣本上機(jī)提取(qǔ)核(hé)酸(suān)，並(bìng)按(àn)照要求回(huí)收(shōu)提取好(hǎo)的核酸(suān)備(bèi)用。
要(yào)點(diǎn)提示(shì)：
1，不同的提取儀(yí)器和試(shì)劑的提取效率可(kě)能存(cún)在差(chà)異，請一定(dìng)嚴(yán)格(gé)按照提取試(shì)劑盒的說(shuō)明書進行核(hé)酸提取操作。
2，有條(tiáo)件時可以(yǐ)考慮(lǜ)配(pèi)備小型化的核酸提取儀在安全櫃內使用，以進(jìn)一步加(jiā)強生物安全防護(hù)；若(ruò)使(shǐ)用在安全(quán)櫃外的(dí)核(hé)酸(suān)提(tí)取儀，則(zé)一(yī)定(dìng)要(yào)做好(hǎo)生(shēng)物安全防護及樣(yàng)本的防汙染保(bǎo)護(hù)。
四，PCR體係(xì)的(dí)配製(zhì)和模板加樣(yàng)
1，操作流程：
在(zài)基因擴增實驗室的(dí)試(shì)劑配製區或(huò)單獨的實驗室，配(pèi)製(zhì)PCR體係。根據(jù)試(shì)劑盒(hé)說明(míng)書的要求，將試(shì)劑盒(hé)的不同組分（一(yī)般(bān)包括(kuò)反應液，酶，引物等）按(àn)照各自必(bì)須的體積(jī)量(liáng)進行(háng)配製混合，充分混匀並(bìng)離(lí)心後，通(tōng)過傳(chuán)遞(dì)窗(chuāng)傳遞到(dào)核酸提(tí)取和(hé)加樣區，或(huò)由(yóu)專(zhuān)人(rén)從(cóng)試劑配(pèi)製實驗(yàn)室(shì)送(sòng)至核酸提(tí)取和加樣實驗室(shì)。在加樣生(shēng)物安全櫃內(nèi)，根據檢(jiǎn)測(cè)樣本(běn)例(lì)數(shù)分(fēn)裝(zhuāng)體係到每(měi)個反應管中(zhōng)，逐一(yī)將樣(yàng)本(běn)核酸加入到對應的(dí)反應(yīng)管中(zhōng)，並(bìng)加蓋密(mì)閉好PCR反(fǎn)應(yīng)管；每批(pī)次(cì)檢(jiǎn)測需要做(zuò)一(yī)個陽(yáng)性對照和(hé)3個陰(yīn)性(xìng)對照。
2，要點提(tí)示(shì)：
（1），試劑配製必須嚴(yán)格(gé)在試(shì)劑(jì)配(pèi)製區或單獨(dú)，潔(jié)淨(jìng)的實驗室和(hé)安全櫃(guì)內(nèi)進行，以確保試劑(jì)不會有被汙染的(dí)可(kě)能。
（2），試劑配製時要根據(jù)檢(jiǎn)測樣(yàng)本數量進行合理配製，每批(pī)次(cì)檢(jiǎn)測(cè)均需要(yào)包(bāo)括(kuò)3個(gè)陰性對(duì)照(zhào)和(hé)1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的試劑，同時還(huán)需(xū)要(yào)考(kǎo)慮試劑分配過(guò)程中的正常損(sǔn)耗等消(xiāo)耗(hào)。
（3），加(jiā)樣可以和樣本處(chǔ)理/核酸提(tí)取在同(tóng)一分區或(huò)同一間(jiān)實驗室進(jìn)行(háng)，但(dàn)如(rú)有條件(jiàn)hao在單(dān)獨的加(jiā)樣區或(huò)至少(shǎo)使用(yòng)安(ān)全(quán)櫃進行(háng)加樣。
（4），體(tǐ)係分裝(zhuāng)建(jiàn)議每(měi)次(cì)更換新(xīn)的吸頭(tóu)，避(bì)免(miǎn)反(fǎn)復使(shǐ)用帶(dài)來體積誤(wù)差(chà)和(hé)交叉汙(wū)染。
（5），應(yīng)配(pèi)置(zhì)體(tǐ)係(xì)加樣(yàng)登(dēng)記(jì)表，確保(bǎo)加(jiā)樣過(guò)程(chéng)準(zhǔn)確(què)無誤。
（6），PCR密(mì)閉管(guǎn)蓋應特別謹慎，建議(yì)更換(huàn)新的(dí)手套(tào)，防止(zhǐ)手套等接觸管蓋(gài)內部帶(dài)入汙染(rǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。
五(wǔ)，上機(jī)檢測及結果(guǒ)分析
1，操(cāo)作(zuò)流(liú)程：
在擴(kuò)增區或(huò)擴增實(shí)驗室(shì)，由(yóu)專(zhuān)人(rén)取出配(pèi)製好的PCR檢測(cè)管，混匀，離心後(hòu)，小心(xīn)上(shàng)機(jī)檢測，按照(zhào)試劑盒(hé)說明(míng)書設(shè)置(zhì)擴增參(cān)數(shù)並(bìng)分析(xī)判(pàn)讀結果。進(jìn)行結果(guǒ)分析(xī)時(shí)，應(yīng)認真閱(yuè)讀(dú)試劑盒(hé)說明書，在(zài)了解(jiě)該試(shì)劑盒(hé)的靈(líng)敏(mǐn)度，檢測方法和(hé)局限性(xìng)等技(jì)術特點的基礎上，結(jié)合該批次(cì)陰性(xìng)質(zhì)控的(dí)結果，綜(zōng)合判讀樣本的檢(jiǎn)測結果。檢(jiǎn)測(cè)結束後，為防(fáng)止可能的擴增汙(wū)染，擴(kuò)增(zēng)結(jié)束後(hòu)的(dí)PCR管(guǎn)嚴禁開蓋或帶(dài)離(lí)擴增實驗室，應盡(jìn)快通(tōng)過(guò)可密封(fēng)塑料(liào)袋(dài)等(děng)容(róng)器(qì)盛裝密(mì)閉(bì)後，放(fàng)入醫(yī)療(liáo)垃圾(jī)桶中(zhōng)做進(jìn)一(yī)步(bù)處(chǔ)理。
2，要點提示(shì)：
（1），因基(jī)因(yīn)擴增區存(cún)在(zài)汙(wū)染的(dí)風險(xiǎn)，應(yīng)設(shè)專門的擴增區域(yù)或在單(dān)獨的(dí)實驗室(shì)進行擴增，必須和(hé)核(hé)酸提(tí)取，試劑(jì)配製(zhì)區域(yù)有嚴格(gé)的物理分割(gē)。
（2），不同操(cāo)作(zuò)區(qū)域的工(gōng)作服不要混穿，特別(bié)是(shì)基(jī)因擴(kuò)增區的工(gōng)作(zuò)服(fú)，建(jiàn)議僅(jǐn)在擴(kuò)增區域或(huò)擴(kuò)增實驗(yàn)室內使(shǐ)用(yòng)。
（3），熟悉(xī)檢(jiǎn)測用PCR儀器(qì)的基本性能(néng)和(hé)特(tè)點，能客(kè)觀(guān)分(fēn)析(xī)判(pàn)斷檢(jiǎn)測(cè)結果。
六，檢(jiǎn)測後(hòu)的(dí)消(xiāo)毒處理
1，操(cāo)作(zuò)流程：
（1），生物安(ān)全櫃(guì)內：在完(wán)成樣(yàng)本核酸提取(qǔ)後(hòu)，應(yīng)在(zài)安(ān)全(quán)櫃(guì)內(nèi)用75%消毒(dú)酒(jiǔ)精對外層(céng)手套進行消毒處理(lǐ)，並(bìng)將外層手套(tào)取下(xià)後(hòu)棄至(zhì)安全(quán)櫃(guì)內(nèi)的垃圾桶中。小心收納並(bìng)丟棄(qì)使(shǐ)用過(guò)的(dí)一次(cì)性吸(xī)水(shuǐ)台(tái)布，用(yòng)0，5%~1%的有(yǒu)效氯(lǜ)消毒劑(jì)或75%酒(jiǔ)精(jīng)擦拭安全(quán)櫃(guì)台麵，移液(yè)器等安全櫃內(nèi)全部儀器(qì)的表(biǎo)麵(miàn)。將(jiāng)安全櫃(guì)內產生(shēng)的新型(xíng)guan狀(zhuàng)病(bìng)毒(dú)相(xiāng)關(guān)醫療垃(lā)圾(jī)經(jīng)3層(céng)包(bāo)裝(zhuāng)後(hòu)，轉(zhuǎn)移至(zhì)實驗室(shì)的(dí)醫療(liáo)垃圾桶中。開啟(qǐ)紫外(wài)燈照射(shè)生(shēng)物安(ān)全(quán)櫃(guì)，時間應大於30分鐘(zhōng)。
（2），樣本核酸提取(qǔ)工作人(rén)員(yuán)實(shí)驗室內：他(tā)人協助用(yòng)0，5%~1%的有(yǒu)效氯(lǜ)消毒劑或(huò)75%酒精(jīng)均(jūn)匀噴(pēn)灑內(nèi)層(céng)手套，袖口，手臂(bì)及隔離(lí)衣後(hòu)，將外層反(fǎn)穿(chuān)隔離(lí)衣(yī)脫下至(zhì)新(xīn)型guan狀病(bìng)毒醫療垃圾桶中(zhōng)送高(gāo)壓處理(lǐ)。
（3），樣本(běn)處理(lǐ)實驗室內：用0，5%~1%的有效氯消毒劑或(huò)75%酒精消毒(dú)實驗(yàn)室台麵(miàn)和(hé)地麵(miàn)；開(kāi)紫外(wài)燈(dēng)進(jìn)行(háng)大於30分(fēn)鐘(zhōng)的(dí)空間消毒(dú)。
（4），工作人員摘(zhāi)脫(tuō)三級防(fáng)護：在(zài)緩衝區戴(dài)新的外層手套，摘(zhāi)護目(mù)鏡置於(yú)75%酒精浸泡(pào)消(xiāo)毒(dú)，從頭開(kāi)始，自上而下(xià)，由內而外(wài)緩慢翻(fān)轉脫(tuō)下一次(cì)性防hu服，直到(dào)將(jiāng)一(yī)次(cì)性(xìng)防(fáng)水靴(xuē)套全(quán)部(bù)脫(tuō)下(xià)，將防hu服(fú)置(zhì)於新型guan狀病毒(dú)醫療(liáo)垃圾(jī)桶中送高(gāo)壓(yā)處理(lǐ)。摘kouzhao，帽子，內(nèi)層鞋套(tào)和內(nèi)層(céng)手套後同樣置(zhì)於(yú)新(xīn)型(xíng)guan狀病毒(dú)醫療(liáo)垃圾桶(tǒng)中(zhōng)送(sòng)高壓(yā)處(chǔ)理(lǐ)。
（5），新(xīn)型guan狀病(bìng)毒相關醫療(liáo)垃圾：所有新型(xíng)guan狀病毒(dú)相關醫療垃圾均需(xū)經濕(shī)熱(rè)高壓滅(miè)菌(jūn)後再(zài)作為普(pǔ)通(tōng)醫療垃圾處理，且垃(lā)圾袋上應(yīng)標注新型guan狀病(bìng)毒(dú)醫(yī)療垃圾的(dí)相關信息。高(gāo)壓(yā)處理前後的垃(lā)圾(jī)要嚴(yán)格區(qū)分，在(zài)高(gāo)壓滅菌(jūn)區(qū)域(yù)對(duì)新(xīn)型(xíng)guan狀病毒醫(yī)療垃(lā)圾(jī)進(jìn)行濕(shī)熱(rè)高壓滅菌處理，高壓(yā)參數為121℃，30分鐘。高(gāo)壓要(yào)做物(wù)理(lǐ)，生(shēng)物指(zhǐ)示，以確保高壓(yā)滅(miè)菌的效(xiào)果。
2，要點提示：
（1），生(shēng)物安全(quán)櫃內是風險gao區域(yù)，操作者的(dí)外(wài)層(céng)手套經消毒(dú)後(hòu)必(bì)須脫(tuō)在(zài)安全櫃內。
（2），靴(xuē)套或鞋套(tào)的(dí)主要作用(yòng)是對操作(zuò)者(zhě)的(dí)腳(jiǎo)和腿部(bù)進行防(fáng)護，要(yào)求(qiú)必(bì)須防水，以確(què)保(bǎo)在實驗室內發生意外遺灑(sǎ)時(shí)可(kě)隔離(lí)汙染(rǎn)。
（3），核酸(suān)提(tí)取儀內部(bù)，生(shēng)物(wù)安(ān)全(quán)櫃內部(bù)和(hé)實驗室空間均(jūn)應進(jìn)行(háng)紫(zǐ)外(wài)綫(xiàn)消毒(dú)，但紫(zǐ)外(wài)綫對空(kōng)氣(qì)的(dí)消毒效(xiào)果(guǒ)好(hǎo)，對物(wù)體表麵的消(xiāo)毒效果(guǒ)隨(suí)距離變(biàn)遠(yuǎn)而減弱，故在紫外(wài)綫消(xiāo)毒前，仍(réng)需對(duì)各種儀器表麵(miàn)，台麵，地(dì)麵用(yòng)消毒(dú)劑進行(háng)擦拭(shì)消毒。
（4），工(gōng)作(zuò)人員(yuán)在摘脫個(gè)人三級防護後(hòu)，仍應(yīng)參照(zhào)實驗室原有實驗後操作流(liú)程進行(háng)嚴(yán)格(gé)認真的(dí)常規(guī)消毒(dú)處理，特(tè)別是(shì)實驗(yàn)後(hòu)的(dí)手(shǒu)衛(wèi)生(shēng)環(huán)節。
以上(shàng)為(wéi)SICOLAB整(zhěng)理，實(shí)驗(yàn)室整(zhěng)體(tǐ)設計建(jiàn)設工(gōng)程，生物樣(yàng)本(běn)建設(shè)工程(chéng)，GMP環(huán)境(jìng)建設(shè)工(gōng)程，環保(bǎo)工(gōng)程(chéng)。
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